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核酸检测是什么原理,什么是Ct值,怎么去理解阳性和阴性

2024-06-20 08:41:02      点击:854
原标题:核酸检测是核酸和阴什么原理,什么是检测Ct值,怎么去理解阳性和阴性

近年来,什原核酸检测差不多成了一个无人不知无人不晓的理什理解词。那什么是值去核酸检测,基本原理又是阳性什么样的呢?

核酸检测,就是核酸和阴通过检测病毒的核酸,来确定一个人是检测否感染病毒的方式,如果在核酸检测中观察到了阳性反应,什原即表明感染;如果阴性则基本排除感染。理什理解一般而言:阳性=感染。值去

关于核酸检测的阳性原理,我在一个回答中非常详细的核酸和阴介绍过,如果想了解可以戳这个回答。检测

这个文章中,会稍为全面和深入的介绍核酸检测。

对于病毒,目前有多种方式可以达到检测和追踪的目的。比如常说的抗原检测,抗体检测等。在新出的新冠诊疗方案中,就增加抗原检测作为补充方案。世界卫生组织(WHO)也建议将抗原检测作为新冠早期诊断的辅助手段。对于普通群众来说,抗原检测其实更具操作性,就像早孕试剂一样,药店几十块买个试剂盒,回家一会儿就知道结果,根本不用太麻烦。

即便抗原抗体检测如此便捷,核酸检测还是具有无可撼动的位置,成为当之无愧的确诊依据,毕竟排队时间长不要紧,准确才是关键。

在生命体分类中,病毒是最尴尬的存在。病毒的组成实在是太简单了,简单到都难以被划分为生命体。因为如果病毒是生命,那么你得符合一般生命体的特征,得具有新陈代谢能量代谢这些功能,简单来说就是你得吃喝拉撒。可是病毒在环境中就像死了的一样,它的所有活动都是通过寄生宿主来完成的。感染宿主之后病毒才能被激活而具有复制功能。但在环境中,病毒就是物质而不是生命,所以病毒在科学界一直难以界定,骑跨在生命和非生命体之间。

我们以新冠为例,要检测这种病毒是否感染人体,首先得取样,无论是咽拭子还是鼻拭子等体液样品,只要病毒感染人体通过潜伏期复制了一段时间,体液中一般会有病毒样品的存在,因为病毒感染,就是一个侵入宿主细胞复制组装自己,然后释放自己后代的过程。其过程可以用图1表示。

图1.病毒侵入宿主过程

图1,是一个噬菌体病毒侵入宿主的基本途径。分为 1. 吸附到宿主细胞表面;2. 注入,包括打通细胞膜并注入自己的核酸物质;3.合成,病毒RNA利用宿主细胞环境合成自己的各部分物质;4. 组装,病毒后代各种物质组装成新的病毒颗粒。5. 释放,新病毒颗粒打破宿主细胞膜并释放出来进入。

新冠检测,就是检测体液中存在的病毒数目。但是病毒颗粒太小,直径只有100万分之一米左右(100纳米左右),肉眼甚至普通显微镜无法看见更不能定量检测。所以目前只能基于病毒的组成特征,开发仪器方法识别病毒特征。

图2. 病毒典型结构

如图2. 病毒主要由蛋白,核酸还有一些物质(如多糖等)组成。病毒在感染中主要通过其表面的刺突蛋白和宿主细胞膜表面的受体接触从而引发免疫反应,这部分蛋白物质一般被称为抗原物质。所以抗原检测就是检测这部分蛋白的存在;病毒进入宿主细胞内会引起免疫反应,人体免疫系统大动员分泌一种叫抗体的物质,专门用来和抗原结合消灭抗原,抗原检测原理就出在这儿。

比如在胶体金法抗原抗体检测中,如果一份样品中有病毒(那就有抗原),我们让样品和人工制备的抗原接触,抗体和抗原相互结合形成抗体复合物,被胶体状的金离子溶液包裹后,会聚集产生肉眼可见的条带,即阳性反应来确定感染。

按理来说抗原抗体检测方法是可靠的,但其实在实际操作中出现的假阴性或者假阴性的概率很大,灵敏度和准确性都不高,因为采集样品需要血液样品,过程操作繁琐且样品容易受到污染;在病毒载量低的情况下,检测本身就不灵敏容易出现假阴性。综合这些因素,将核酸检测推上了确诊金标准。

事实上,无论是咽拭子还是鼻拭子甚至血液采样,样品中病毒的含量都是比较低的,即使在重症感染者体内(病毒载量大);因为病毒颗粒太小加之采样量有限,样品中含有的病毒数目对于核酸检测还是太少,那怎么办?

不行就扩增吧,先扩增几十万倍再检测?于是核酸PCR检测华丽登场。

如图2,无论病毒颗粒含有多少种蛋白或其他物质,它核心都存在着一套遗传物质,其全部生命活动也由遗传物质所控制。对新冠,这套遗传物质就是核酸RNA了,那么我们扩增病毒的核酸RNA数就等于是扩增了病毒数了,然后扩增到一定量了,自然就可以更加直观和灵敏的检测到病毒的存在了。核酸检测的名称,就是这么来的。

核酸检测用到的仪器,叫做PCR (聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction )仪器,在生化领域内是常见的不能再常见的仪器,专门负责遗传物质的复制。我们以荧光定量PCR仪器为例,既然一个样品中病毒含量太少,我们干脆不去努力获得更多的样品以达到很多的复制体,直接咽拭子鼻拭子取样,只要样品中含有RNA(比如低到10的负12次方的摩尔浓度),然后用PCR仪器体外扩增就行了。

PCR的扩增是指数级增长的,这个我在前面文章中说话,比如样品中有一个病毒,PCR扩增第1轮,翻倍成2个,然后在2的基础上扩增第2论,就是4个(2的2次方),第3轮扩增是8个(2的3次方),以此类推,第n轮扩增就是2的n次方。如图3所示,扩增以2位底数指数级增长的。

图3. RNA 扩增图示

注意,这儿的n其实就是所谓的Ct值,全名叫Cycle threshold,即循环数阈值,在核酸检测中是个很重要的概念,n的大小,决定了扩增多好轮病毒RNA,扩增的的次数也多,RNA的量越大越能引起荧光反应。

我举过一个栗子,假设工具人A感染了一个病毒在没有任何症状的情况下,核酸检测怎么区分他是阳性还是阴性?好,我咽拭子取样如图4,然后用PCR扩增样品,并设定Ct为30即跑PCR为30个循环,循环结束没有看到足够量的病毒数(RNA数)所导致的荧光,此时工具人A为阴性

图4. 取样例子

但如果不放心结果,把Ct调到100次,使得这一个病毒的核酸数直接扩增了100代。此时由于病毒RNA数量达到了检测所需的最低值,仪器出现了可见的荧光。然后又可以判定工具人A其实是阳性?那到底A是阳性还是阴性,怎么定义准去呢?

由于病毒的扩增是2的指数级增长,n之越大,越增加一个数量级,引起的扩增量的差异就越明显,比如,2的8次方256, 而2的10次方1024,两者差了将近700多;2的30次方是越10亿,而2的32次方式42亿多,这差距就一下子出来了。直观的感受请看图5。

图5. 核酸PCR扩增曲线

图5是在PCR循环中,随着循环数增大,病毒数量的变化曲线。右边是荧光强度,比如当图中循环次数即Ct值等于19的时候,反应体系中RNA病毒数的量达到了引发荧光反应的最低值,此时出现了荧光反应即阳性,我们定义得了新冠。

但是在工具人A的例子中,他只感染了一个病毒,如果他不测核酸或者核酸测的不及时,他强大的自身免疫系统可能早就将这一个病毒清除了,所以在核酸检测中,Ct值的设定,其实是非常关键的。怎么科学的定义Ct值,既不漏筛也不过度防疫,就是首要的问题了。

卫健委从疫情开始,迄今为止公布了9版新冠肺炎诊疗方案,在第二版中的确诊标准中,Ct值为35,也就是核酸检测的样品一律扩增35轮,然后检测是不是有荧光反应,如达到了阈值,则为阳性,如果没有,即为阴性

图6.轻症和无症状多

近日青岛和吉林等地发现的病例,大多是无症状感染者或者轻症图6。当然,轻症或者无症状在一定程度上是会造成社区传染的,从两地几日新增案例就可以看出来。因为有些是无症状患者,他们正常上班下班,无意之间造成了一些传播,这个传播不测核酸是发现不了的,毕竟谁好好的还要去测个核酸。

但问题是,无症状或者轻型在任何时间都有传染性吗,比如一个人感染了几个病毒,然后我们核酸检测,同时把Ct值调的无限大让几个病毒扩增更多的代数,最后也能检测出病毒引发的荧光反应,接着即使这个人没什么症状也不会传染,依然要果断定义A为阳性?理由是不管怎么说,核酸检测结果就是阳性呀,只要我不说我用的是多大的Ct值就行。

据此,我们第九版诊疗方案适时做出了调整,在第二版的诊疗方案中:阳性定义:Ct值<37(即37个循环);但是在第九版的方案中,阴性定义:无Ct值或者Ct值>40,当然无Ct值很好理解,就是我无论怎么扩增都没有病毒,因为这个人压根没感染病毒,对于Ct值>40,就是说如果核酸检测中发现了荧光阳性,但是此时是循环扩增了40代以上,那其实也可以归位阴性,因为此刻病毒载量太小,荧光原因是由于体外扩增太多而引起的。样品本身病毒不足以造成症状或者感染,高高兴兴回家就是了。

当然在PCR的实际操作中,Ct并不会跑的太高,比如大于45以上,非特异性信号也会增大,从图5看出扩增是是一个S形曲线.PCR的扩增需要加入一些引物,引物是和目标RNA序列相同但是长度很短的片段,他本身会发生聚集或者自身扩增引起干扰信号,所以PCR扩增有个有效的线性范围,但此次的Ct调整,是非常适时且科学的。

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